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                            技術(shù)文章 / article 您的位置:網(wǎng)站首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

                            陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

                            發(fā)布時(shí)間: 2023-10-25  點(diǎn)擊次數(shù): 558次

                            設(shè)備及材料

                            • 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

                            • 陽(yáng)離子脂質(zhì)

                            • 氯仿

                            • 蒸餾水

                            • 緩沖

                            • 帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的玻璃瓶

                            • 玻璃注射器

                            • 氮?dú)饣驓鍤?/span>

                            • 真空系統(tǒng)

                            • 0.22μm 過(guò)濾器(可選)

                            程序

                            1. 將每種脂質(zhì)成分(例如,DOTAP/DOPE)溶解在氯仿中至方便的工作濃度(1-10mg/mL)。

                            2. 使用玻璃注射器將所需量的每種成分等分到玻璃瓶中。有關(guān)處理脂質(zhì)有機(jī)溶液的更多信息

                            3. 全部混合玻璃瓶中的成分。

                            4. 使用氮?dú)饣驓鍤饬餍⌒牡卣舭l(fā)氯仿(在充分通風(fēng)的情況下)。

                            5. 將脂質(zhì)殘留物放在真空泵上 10-15 分鐘,以除去任何殘留的有機(jī)溶劑。

                            6. 從真空泵中取出小瓶,并立即以最終脂質(zhì)濃度的兩倍懸浮在蒸餾水中。

                            7. 將脂質(zhì)分散體超聲處理至澄清(2-5 分鐘)。

                            8. 添加等體積的緩沖液(例如,308mM NaCl、40mM Hepes、pH7.4),并進(jìn)一步超聲處理 2 分鐘。

                            9. 溶液可通過(guò) 0.22μm 過(guò)濾器進(jìn)行滅菌。

                            脂質(zhì)/DNA 混合物的制備

                            1. 將陽(yáng)離子脂質(zhì)分散體與 DNA(每 10μg 脂質(zhì) 1μg)混合在合適的容器中。

                            2. 將脂質(zhì)/DNA 混合物孵育 5 分鐘。在室溫下。

                            3. 5 分鐘后,混合物即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

                            細(xì)胞轉(zhuǎn)染

                            1. 用 HEPES 緩沖鹽水洗滌細(xì)胞單層兩次。

                            2. 將細(xì)胞與脂質(zhì)/DNA 混合物在 HEPES 緩沖鹽水(每 100 mm 培養(yǎng)皿 3 ml 混合物)中于 37°C 孵育 90 分鐘。

                            3. 孵育期結(jié)束后,根據(jù)需要更換培養(yǎng)基或補(bǔ)充。

                            4. 將細(xì)胞培養(yǎng)所需的時(shí)間并收獲。

                            筆記

                            • DOPE:陽(yáng)離子脂質(zhì)的常見(jiàn)摩爾比為3:1和1:1。在某些情況下,全部由陽(yáng)離子脂質(zhì)組成的脂質(zhì)系統(tǒng)已被用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

                            • 所引用的緩沖系統(tǒng)旨在用于體外使用,并不表明該系統(tǒng)可能適合體內(nèi)使用。

                            參考

                            • Leventis, R. 和 Silvius, JR (1990)。生物化學(xué)。生物物理學(xué)。Acta 1023:124-132。



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                            1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺    850725P

                            以下規(guī)格:

                            850725P-25MG   

                            850725P-200MG

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